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所有推薦的檢測 - 捕獲抗體對都能以相同效率識別 BNP 前體（圖中未展示）。然而，重要的是要注意，市售 BNP 檢測試劑對 proBNP 的識別能力存在 18 - 20 倍的差異，因此，所有推薦的組合都已在一組 11 例 HF（心力衰竭）患者的血漿樣本中進行了測試，以確保檢測對 proBNP 具有同等識別能力。這一點在使用不同檢測平臺時尤為重要，因為需要選擇在給定條件和平臺下能最佳發(fā)揮作用的抗體對。
對于 BNP 免疫檢測，我們建議使用重組糖基化 proBNP（C 端 + N 端 GBPs，見第 8 節(jié)）作為標準品，因為血液中 BNP 的前體主要以糖基化 proBNP 的形式存在。
校準曲線：所有推薦的 BNP 免疫檢測都能識別三種具有相同效率的 BNP 前體多肽：合成 BNP、重組非糖基化 proBNP 和重組糖基化 proBNP。圖 5 展示了 9M1 - 24C5（A）和 5T4 - 12（B）兩種基于抗體的免疫檢測的代表性校準曲線。我們之前已詳細描述過 9M1 - 24C5 免疫檢測，并在內(nèi)部測試中證明了其分析靈敏度（使用合成 BNP 作為校準品時）優(yōu)于 0.05 pg/ml（圖 7D）。其他抗體對的分析靈敏度也列于下文的識別部分。
BNP 表位與市售 BNP 檢測試劑的表位具有良好的相關(guān)性：為了確定推薦的 BNP 免疫檢測所識別的表位是否與市售檢測試劑識別的表位相似，我們比較了兩種市售檢測試劑（Alforti STAT BNP 檢測試劑，表位為 36 - 24 和 5 - 13；Siemens 檢測試劑，表位為 26 - 12 和 12 - 2）以及我們的 9M1 - 2429 檢測試劑（分別針對 26 - 12 和 12 - 2 表位）的識別情況。具有相同表位特異性的檢測試劑的檢測結(jié)果相關(guān)性良好。用 BNP 免疫檢測（9M1 - 2429）獲得的檢測結(jié)果與 Alforti STAT BNP 檢測試劑（圖 6A）和 Siemens BNP 檢測試劑（圖 6B）的檢測結(jié)果相關(guān)性良好。使用針對 26 - 12 和 12 - 2 表位的檢測試劑獲得的結(jié)果與針對 37 - 24 和 14 - 21 表位的 Siemens 檢測試劑（圖 6B）的結(jié)果相關(guān)性良好。我們的一種檢測試劑（5M1 - 130）與 Siemens 檢測試劑（r = 0.97）也顯示出良好的相關(guān)性。
每種檢測試劑都使用內(nèi)部標準物質(zhì)進行校準。市售檢測試劑的表位特異性可在 IFCC 網(wǎng)站上查詢。
腦啡肽酶抑制及其對BNP免疫檢測的影響
通過阻止內(nèi)源性BNP的降解來增加其水平，被認為是心力衰竭（HF）治療的一種潛在策略。最近，一種名為Entresto®（“諾欣妥"，譯者注 ）的藥物已獲批準用于HF治療。該藥物的活性成分之一是腦啡肽酶抑制劑，有觀點認為，給HF患者使用這種抑制劑，會使BNP前體肽（proBNP）相關(guān)分子的水平升高 。
市售BNP檢測試劑的設(shè)計通常基于識別兩種表位的抗體對，至少其中一種表位針對BNP分子的C端結(jié)構(gòu)，另一種表位針對BNP環(huán)結(jié)構(gòu)（見圖2中的17 - 118序列）。鑒于腦啡肽酶切割位點位于環(huán)結(jié)構(gòu)，合理推測識別環(huán)結(jié)構(gòu)表位的免疫檢測抗體，在腦啡肽酶改變proBNP的情況下，可能會受到影響。然而，HF患者中proBNP的復(fù)雜多樣性，以及心臟分泌的proBNP活性形式的多樣性，意味著這個問題沒有簡單答案。
我們研究了腦啡肽酶活性對多種BNP免疫檢測的影響，方法是將proBNP暴露于腦啡肽酶。令人驚訝的是，proBNP對腦啡肽酶具有抗性。3C4 - 3G12對腦啡肽酶的抗性似乎是由于腦啡肽酶切割表位的抗性。而捕獲抗體識別環(huán)結(jié)構(gòu)的檢測試劑，如5T4 - 12，確實會因腦啡肽酶切割而受影響，這與預(yù)期一致 。我們發(fā)現(xiàn)5T4 - 12對腦啡肽酶切割敏感，而5T4 - 32也對腦啡肽酶作用有抗性（數(shù)據(jù)未展示）。
我們還發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)過處理的proBNP（它是BNP免疫檢測中主要的待測分子形式）實際上不會被腦啡肽酶切割，因此，僅設(shè)計用于檢測BNP的試劑，不會受到此類藥物（指腦啡肽酶抑制劑類藥物 ）的影響 。
NT - proBNP檢測試劑的研發(fā)
NT - proBNP是proBNP的N端部分，包含76個氨基酸，有7個糖基化位點。已發(fā)現(xiàn)NT - proBNP的生物活性僅為BNP的1/1000，這在一定程度上意味著，在臨床樣本中，NT - proBNP更穩(wěn)定。計算得出的NT - proBNP等電點為8.45，分子質(zhì)量為8.54 kDa。但由于糖基化，其表觀分子質(zhì)量更高 。
糖基化對NT - proBNP檢測的影響
我們的研究表明，NT - proBNP的糖基化會對某些抗體的識別產(chǎn)生負面影響。NT - proBNP分子的中央?yún)^(qū)域（如28 - 56位）因去糖基化而容易被抗體識別，而13 - 27位和61 - 76位區(qū)域的糖基化則已被充分認識 。
為了減少糖基化對NT - proBNP測量的影響，我們使用了來自8例HF患者的樣本，這些樣本在去糖基化前后，分別用兩種檢測試劑進行檢測：一種檢測試劑的抗體對針對無 糖基化位點（15C4 - 13G12），另一種檢測試劑的抗體對針對糖基化位點（11D1 - 13G12）。圖7顯示，去糖基化對后一種檢測試劑的檢測結(jié)果有顯著影響。
在檢測NT - proBNP時，糖基化及其對檢測的影響應(yīng)在檢測試劑研發(fā)過程中予以考慮。建議選擇對糖基化不太敏感的抗體 。
圖7 糖基化對NT - proBNP檢測有不同程度的影響
使用兩種不同的免疫檢測方法（A為Alforti NT - proBNP檢測試劑，識別無 糖基化表位；B為針對糖基化表位的檢測試劑 ），對8例HF患者樣本在去糖基化前后的樣本進行檢測。兩種檢測試劑在檢測天然（糖基化）形式（黑色圓點）和去糖基化形式（紅色圓點）的NT - proBNP時，結(jié)果差異顯著。在A檢測試劑中，去糖基化幾乎不影響檢測；而在B檢測試劑中，去糖基化會使檢測信號大幅改變 。
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